本指导原则旨在指导注册申请人准备及撰写重组胶原蛋白创面敷料注册申报资料，同时也为技术审评部门审查注册申报资料提供参考。

       本指导原则是对重组胶原蛋白创面敷料产品的一般要求，注册申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

       本指导原则是供注册申请人和技术审评人员使用的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行。如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料。需在遵循相关法规和强制性标准的前提下使用本指导原则。

       本指导原则是在现行法规、标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

一、适用范围

本指导原则适用于按第二类医疗器械管理的重组胶原蛋白创面敷料，其结构组成中含有重组胶原蛋白成分（不包括动物组织提取的胶原蛋白成分），用于非慢性创面及其周围皮肤的护理。产品通常为凝胶、液体、敷贴、膏状等型式，包括一次性使用的产品和开封后多次使用的产品，以无菌形式或非无菌形式提供。产品中所含成分不具有药理学作用，不可被人体吸收。对产品分类和属性不明确的，需申请产品的分类和属性界定。

二、注册审查要点

（一）监管信息

注册申请人应提供申请表、既往沟通记录（如不适用，应当明确声明申报产品没有既往申报和/或申报前沟通）、关联文件（如主文档授权信）及其他管理信息等。

1、申请表 

1.1产品名称

产品名称应符合《医疗器械通用名称命名规则》等相关法规、规范性文件的要求。产品名称的材料部分统一为“重组胶原蛋白”，如重组胶原蛋白凝胶敷料、重组胶原蛋白创面敷贴等。除非有充分资料证明重组胶原蛋白原材料的结构特征等能够给申报产品功能带来额外获益，产品名称不区分具体材料特征。

1.2管理类别、分类编码

申报产品中所含的重组胶原蛋白（不包括动物组织提取的胶原蛋白成分）等成分不具有药理学作用，不可被人体吸收时，按第二类医疗器械管理，参考《医疗器械分类目录》中分类编码为14注输、护理和防护器械-10创面敷料的第二类医疗器械相关描述。根据不同的产品型式，二级产品类别可为-01创面敷贴、-04凝胶敷料、-08液体、膏状敷料等。

1.3注册单元划分的原则和实例

申报产品的注册单元原则上以产品的技术原理、主要结构组成、性能指标和适用范围为划分依据，同时应满足《医疗器械注册单元划分指导原则》相关要求。例如：

1.3.1凝胶型、液体型、敷贴型等产品，主要组成成分相同但配比不同，性能指标存在差异而影响产品安全有效性时，建议划分为不同的注册单元。

1.3.2凝胶型、液体型等产品，主要组成成分和配比相同，包装材质不同（包装对产品性能无影响）时，如低硼硅西林瓶和聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）喷瓶，建议划分为同一个注册单元。

1.4型号规格

应明确申报产品的型号规格。

1.5结构及组成

结构及组成中组分名称应规范。产品所含成分可能涉及很多种类，但所含成分不应具有药理学作用，不可被人体吸收。产品结构及组成原则上不体现重组胶原蛋白原材料的结构特征、氨基酸序列等相关信息（除非有充分资料证明重组胶原蛋白原材料的结构特征等能够给申报产品功能带来额外获益）。

2.产品列表

应明确列出拟申报产品的型号、规格、结构及组成、附件，以及每个规格型号的标识和描述说明。

（二）综述资料

1.产品描述

1.1工作原理

应描述申报产品的工作原理。如通过在创面表面形成保护层，起物理屏障作用。用于非慢性创面及其周围皮肤的护理。

1.2结构组成

申报产品含重组胶原蛋白成分、成膜成分或高分子增稠成分、保湿润滑成分、调节剂、乳化剂、防腐成分、缓冲剂、溶剂、基质载体等。产品中除重组胶原蛋白外，其他常见的组成成分有：聚乙烯醇、聚乙二醇、卡波姆、黄原胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、甘油、丙二醇、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、三乙醇胺、油酸山梨坦（司盘80）、鲸蜡硬脂醇、尼泊金甲酯钠、尼泊金丙酯钠、苯氧乙醇、羟苯甲酯、醋酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、注射用水、纯化水、无纺布贴等。产品通常为凝胶、液体、敷贴、膏状等型式，一次性使用或开封后多次使用，无菌形式或非无菌形式提供。

1.3型号规格

对于存在多种型号规格的申报产品，应当明确各型号规格的区别。应当采用对比表或带有说明性文字的图片、图表，描述各种型号规格的结构组成、功能、产品特征和技术参数等内容。应清晰、准确表述产品的全部型号/规格，型号/规格可以以装量或尺寸等形式表述，例如：5mL、10g、15mL/瓶、20g/支、25g/贴等，不得出现“依据客户需求可提供定制型号”。不得出现误导或超出申报产品描述以及预期用途范畴的表述内容。

1.4 包装说明

说明申报产品组成的包装信息，以无菌形式提供的医疗器械，应当说明其无菌屏障系统的信息；以非无菌形式提供的医疗器械，应当说明保持其微生物指标的包装信息。说明如何确保最终使用者可清晰地辨识包装的完整性。

1.5研发历程

阐述申报产品的研发背景和目的。如有参考的同类产品或前代产品（如有），应当提供同类产品或前代产品的信息，并说明选择其作为研发参考的原因。

1.6与同类和/或前代产品的参考和比较

列表比较说明申报产品与同类产品和/或前代产品（如有）在工作原理、结构组成、制造材料、性能指标、作用方式、适用范围等方面的异同。

2.适用范围和禁忌证

2.1适用范围

2.1.1应当描述申报产品的适用范围，明确预期用途。如通过在创面表面形成保护层，起物理屏障作用。用于非慢性创面及其周围皮肤的护理。如产品宣称其他的适用范围，应与临床评价结论一致，应有充分的临床数据支持。

2.1.2明确目标用户及其操作或使用申报产品应当具备的技能/知识/培训。明确申报产品为一次性使用或开封后多次使用。如适用，明确与申报产品联合使用实现预期用途的其他产品的详细信息。

对于已获得批准的部件或配合使用的附件，应当提供注册证编号和国家药监局官方网站公布的注册证信息。

2.2预期使用环境

应明确申报产品使用场所要求，如医疗机构、家庭等，明确使用环境要求，如需要无菌/非无菌操作的非慢性创面护理等。

2.3适用人群

应详述申报产品的适用人群。

2.4禁忌证

应说明申报产品临床应用的禁忌证，应当明确说明申报产品不适宜应用的特定的人群或特定情况等信息，如：对原材料过敏者禁用，对不明确过敏者慎用等。如适用，通过风险/受益评估后，针对某些疾病、情况或特定的人群（如儿童、老年人、孕妇及哺乳期妇女、过敏体质人群），认为不推荐使用该产品，应当明确说明。

3.申报产品上市历史

如适用，应当提交申报产品的上市情况、不良事件和召回、销售不良事件及召回率。

（三）非临床资料

1.产品风险管理资料

应依据GB/T 42062提供产品风险管理报告。注册申请人应重点说明：申报产品的研制阶段已对有关可能的危害及产生的风险进行了估计和评价，针对性地实施了降低风险的技术和管理方面的措施。产品性能测试对上述措施的有效性进行了部分验证，达到了通用和专用标准的要求。注册申请人对所有剩余风险进行了评价，全部达到可接受的水平。产品风险分析资料应为注册申请人关于产品安全性的承诺提供支持。应对申报产品的可能危害进行判定并列出清单（见附件表1）。

2.医疗器械安全和性能基本原则清单

说明申报产品符合《医疗器械安全和性能基本原则清单》各项适用要求所采用的方法，以及证明其符合性的文件。对于《医疗器械安全和性能基本原则清单》中不适用的各项要求，应当说明理由。

3.产品技术要求及检验报告

3.1产品技术要求

产品技术要求的制定应符合《医疗器械产品技术要求编写指导原则》的相关法规要求。本条款给出需要考虑的产品主要技术指标，如有其他指标，建议注册申请人结合YY/T 1627等适用标准、产品设计特点及临床应用进行制定。注册申请人如不采用的条款（包括国家标准、行业标准要求），应当说明理由。

3.1.1产品型号/规格及其划分说明

应说明申报产品的型号/规格，明确产品型号/规格的划分说明。

3.1.2性能指标

申报产品的性能指标建议包含以下几点（包括但不限于此）：外观、装量（或尺寸、质量）、重组胶原蛋白的鉴别、重组胶原蛋白的含量、粘度/黏度（如适用）、化学性能（如酸碱度、重金属等）、无菌（或微生物指标），如有配合使用的附件（如喷瓶、滴管等）应制定相应要求等。

注册申请人如宣称其他技术参数和功能，应在产品技术要求中予以规定，符合《医疗器械产品技术要求编写指导原则》的相关法规要求。

3.1.3检验方法

申报产品的检验方法应根据性能指标制定，优先采用已颁布的标准或公认的检验方法。

考虑到产品的成分、配比可能对检验结果产生影响，因此产品技术要求中采用的具体检验方法应经过验证，以保证检验结果的可靠性。比如重组胶原蛋白的鉴别和含量的检验方法，应结合产品实际情况，采用适宜的方法。

3.2产品检验报告

可提交注册申请人出具的自检报告或委托有资质的医疗器械检验机构出具的检验报告。若提交自检报告，应按照《医疗器械自检管理规定》的要求提供相关资料。

3.3同一注册单元内注册检验典型性产品确定原则及示例

同一注册单元中所检验产品应能够代表注册单元内其他产品安全性和有效性。代表产品的确定可以通过比较同一注册单元内所有产品的主要原材料、生产工艺、技术结构、性能指标和预期用途等资料，说明其能够代表注册单元内其他产品的安全性和有效性。必要时提交不同型号规格产品的差异性检测报告。

4.研究资料  

根据申报产品适用范围和技术特征，提供非临床研究综述，逐项描述所开展的研究，概述研究方法和研究结论。根据非临床研究综述，提供相应的研究资料，各项研究可通过实验室研究、模型研究、文献研究等方式开展，一般应当包含研究方案、研究报告。采用建模研究的，应当提供产品建模研究资料。

4.1性能研究

应当提供产品化学/材料表征、物理、性能指标及检验方法的确定依据、设计输入来源以及临床意义，所采用的标准或方法、采用的原因及理论基础。

申报资料中应明确各种原材料的名称、重组胶原蛋白原材料的生产工艺（如适用）、质量控制指标及要求等，说明原材料的功能特点或选择依据。

对于首次用于医疗器械方面的新材料，应提供该材料适合用于符合预期用途的相关研究资料。

如有配合使用的附件（如喷瓶、滴管等）应制定相应要求，考虑附件与产品的适宜性等。

4.2生物学特性研究

申报产品接触使用者的非慢性创面及其周围皮肤，属于表面接触器械，接触时间结合产品的使用方法确定。

申请人如进行生物学试验，应按GB/T16886.1选择适用的试验项目，试验项目的选择应结合产品预期接触的部位以及产品累积使用的接触时间，根据现行版GB/T 16886.1，考虑细胞毒性、致敏反应、皮内反应项目等。

申请人如开展申报产品与市售产品的等同性比较的生物相容性评价，应按照《医疗器械生物学评价和审查指南》，提供资料证明申报产品与已上市产品具有等同性。

4.3灭菌（除菌）工艺研究

以无菌形式提供的产品，应提交产品包装及灭菌（除菌）方法选择的依据，经过确认并进行常规控制。应考虑选用的灭菌（除菌）工艺是否会对重组胶原蛋白产生影响。注册申请人应开展以下方面的研究：

4.3.1产品与灭菌（除菌）过程的适应性：应考察灭菌（除菌）方法等工艺过程对于产品的影响。

4.3.2包装与灭菌（除菌）过程的适应性。

4.3.3如适用，应明确灭菌工艺（方法和参数）和无菌保证水平（SAL），无菌保证水平（SAL）应达到10-6，提供灭菌确认报告。可根据适用情况选择灭菌方式：

如采用湿热灭菌，参照GB 18278.1标准的要求开展研究；

如采用辐射灭菌，参照GB 18280.1、GB 18280.2、GB/T 18280.3等标准的要求开展研究。

4.3.4若申报产品不能耐受终端灭菌工艺，需提供依据及不能耐受的验证资料。

如适用，应明确采用的除菌工艺，如过滤除菌等。应明确除菌工艺（方法和参数）和保证水平，提供确认报告。

4.4稳定性研究

4.4.1货架有效期

应提供货架有效期研究资料，证明在货架有效期内，产品可以保持性能功能满足使用要求。注册申请人需在试验方案中设定检测项目、检测方法及判定标准。检测项目包括产品自身性能检测和包装系统性能检测两方面。实时稳定性试验结果是验证产品货架有效期的直接证据。当加速稳定性试验结果与其不一致时，应以实时稳定性试验结果为准。

对于非无菌形式提供的产品，开封后可以多次使用时，应对其开封后稳定性进行研究。为确认产品开封后，在实际使用环境下，经过一段时期仍然能够满足使用要求的最长存放时间，建议通过分析评价后选择合适的检测项目（如微生物指标等），提供研究报告。

产品以无菌和非无菌两种形式提供时，应分别进行有效期的研究。

4.4.2包装研究

应提供包装研究资料，证明在生产企业规定的运输贮存条件下，运输和贮存过程中的环境条件（例如：震动、振动、温度、湿度、光线的波动）不会对产品的性能造成不利影响。

注册申请人应提交最终成品包装的初始完整性和维持完整性的验证资料。对于在加速稳定性试验中可能导致产品变性而不适于选择加速稳定性试验研究其包装的情况，应以实时稳定性试验进行验证。

包装研究资料应包括封口试验以及包装材料对灭菌的适应性研究。可依据GB/T 19633系列标准对包装进行分析研究和评价。

4.5证明产品安全性、有效性的其他研究资料

应提供申报产品不可被人体吸收的相关研究资料。如选择或设计可以模拟临床使用方式的试验。

应提供申报产品中重组胶原蛋白成分的质量控制相关资料。建议参照YY/T 1849标准及其他相关标准的要求（如今后有适用的其他标准发布，应参照执行），提供原材料相关质控资料。

申报产品如宣称形成物理阻隔的保护层或具有成膜效果，应提供适用于申报产品的成膜性研究测试资料。

4.6其他资料

对于符合《免于临床评价医疗器械目录》的产品, 注册申请人可根据产品型式选择对应的目录产品免于进行临床评价。

如无菌形式提供的重组胶原蛋白凝胶、液体、敷贴、膏状型产品等，符合《免于临床评价医疗器械目录》中相应产品的描述时，申报产品可按照《列入免于临床评价医疗器械目录产品对比说明技术指导原则》提供相应资料，从基本原理、结构组成、性能、安全性、适用范围等方面，证明产品的安全有效性。

（四）临床评价资料

对于不符合《免于临床评价医疗器械目录》的产品，应按照《医疗器械注册与备案管理办法》《医疗器械临床评价技术指导原则》《医疗器械临床试验质量管理规范》等要求提交临床评价资料。

1.同品种临床评价路径

在满足注册法规要求的前提下，可按照《医疗器械临床评价等同性论证技术指导原则》进行境内已上市同品种产品的对比、分析、评价，并按照《医疗器械注册申报临床评价报告技术指导原则》要求的项目和格式出具评价报告。

2.临床试验路径

临床试验需按照《医疗器械临床试验质量管理规范》开展，提交完整的临床试验资料。临床试验的设计可参考《医疗器械临床试验设计指导原则》，根据注册申请人宣称的申报产品适用范围开展。

（五）产品说明书和标签样稿

产品说明书和标签的编写应符合《医疗器械说明书和标签管理规定》、YY/T 0466.1、YY/T 1627和相关法规、规章、规范性文件、强制性标准的要求。说明书中关于产品性能特征的描述不应超过注册申请人提交的研究资料及产品技术要求，不得含有未经验证的夸大宣传的相关描述。申报产品的说明书和标签原则上不体现重组胶原蛋白原材料的结构特征、氨基酸序列等相关信息（除非有充分资料证明重组胶原蛋白原材料的结构特征等能够给申报产品功能带来额外获益）。应注意以下内容：

1.产品的结构组成及性能指标应与产品技术要求内容一致。

2.无菌形式提供的产品应当注明灭菌方式或除菌工艺、“无菌”等字样或符号；非无菌形式提供的产品应当注明微生物指标、“不适用于无菌操作的非慢性创面护理 ”、“非无菌”字样或符号，防止临床误操作。

3.注明产品主要原材料，应有对材料过敏者禁止使用的提示。

4.使用前检查包装是否完好，如有破损，禁止使用。

5.应标明产品的货架有效期，严禁使用超过货架有效期的产品。

6.产品应注明建议使用时间和使用方法。如产品可多次使用，应当明确提示使用者该产品开封后应如何保存以及限定时间内使用完毕。

7.使用中若有红肿、疼痛或瘙痒等不适症状，请立即停止使用并清洗干净，必要时向医生咨询或及时就医。

8.明确针对产品特点的特殊注意事项、警示信息、可能的不良事件及处理措施等。如创面感染的患者不宜使用等。

三、参考文献

[1]中华人民共和国国务院.医疗器械监督管理条例:中华人民共和国国务院令第739号[Z].

[2]国家市场监督管理总局.医疗器械注册与备案管理办法:国家市场监督管理总局令第47号[Z].

[3]国家药品监督管理局.医疗器械注册申报资料要求和批准证明文件格式:国家药监局公告2021年第121号[Z].

[4]国家食品药品监督管理局.医疗器械注册单元划分指导原则:总局通告2017年第187号[Z].

[5]国家食品药品监督管理局.医疗器械分类目录:国家食品药品监督管理总局公告2017年第104号[Z].

[6]国家药品监督管理局.重组胶原蛋白类医疗产品分类界定原则:国家药监局通告2021年第27号[Z].

[7]国家药品监督管理局.医疗器械安全和性能基本原则清单:国家药监局公告2021年第121号[Z].

[8]国家药品监督管理局.医疗器械产品技术要求编写指导原则:国家药监局公告2022年第8号[Z].

[9]国家药品监督管理局.医医疗器械注册自检管理规定:国家药监局公告2021年第126号[Z].

[10]国家食品药品监督管理局.医疗器械生物学评价和审查指南:国家食品药品监督管理局通知2007年345号[Z].

[11]国家药品监督管理局.列入免于临床评价医疗器械目录产品对比说明技术指导原则:国家药监局通告2021年第73号 [Z].

[12]国家药品监督管理局.免于临床评价医疗器械目录：国家药监局通告2021年第71号[Z].

[13]国家药品监督管理局.医疗器械临床评价技术指导原则:国家药监局通告2021年第73号[Z].

[14]国家食品药品监督管理局.医疗器械说明书和标签管理规定:国家食品药品监督管理总局令第6号[Z].

[15]GB 15979,一次性使用卫生用品卫生标准[S].

[16]GB 18278.1,医疗保健产品灭菌 湿热 第1部分 医疗器械灭菌过程的开发、确认和常规控制要求[S].

[17]GB 18280.1,医疗保健产品灭菌 辐射 第1部分医疗器械灭菌过程的开发、确认和常规控制要求[S].

[18]GB 18280.2,医疗保健产品灭菌 辐射 第2部分：建立灭菌剂量[S].

[19]GB/T 14233.1,医用输液、输血、注射器具检验方法 第1部分：化学分析方法[S].

[20]GB/T 14233.2,医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分：生物学试验方法[S].

[21]GB/T 16886.1,医疗器械生物学评价 第1部分：风险管理过程中的评价与试验[S].

[22]GB/T 16886.5,医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验[S].

[23]GB/T 16886.10,医疗器械生物学评价 第10部分：刺激与皮肤致敏试验[S].

[24] GB/T 18280.3,医疗保健产品灭菌 辐射 第3部分：剂量测量指南[S].

[25]GB/T 19633.1,最终灭菌医疗器械包装 第1部分：材料、无菌屏障系统和包装系统的要求[S].

[26]GB/T 19633.2,最终灭菌医疗器械包装 第2部分：成形、密封和装配过程的确认的要求[S].

[27]GB/T 42062,医疗器械风险管理对医疗器械的应用[S].

[28]GB/T 42061,医疗器械质量管理体系用于法规的要求[S].

[29]YY/T 0466.1,医疗器械用于医疗器械标签、标记和提供信息的符号 第1部分: 通用要求[S].

[30]YY/T 0681.1,无菌医疗器械包装试验方法第1部分：加速老化试验指南[S].

[31]YY/T 0698.2,最终灭菌医疗器械包装材料 第2部分：灭菌包裹材料要求和试验方法[S].

[32]YY/T 1627,急性创面用敷贴、创贴通用要求[S].

[33]YY/T 1849,重组胶原蛋白[S].

[34]中华人民共和国药典（2020版）[S].

附表

产品主要危险（源）

本指导原则旨在指导注册申请人对医疗器械所用重组人源化胶原蛋白原材料进行充分的研究，并整理形成产品注册申报资料，同时也为技术审评部门对重组人源化胶原蛋白制成的产品注册申报资料包括所引用主文档相关内容的技术审评提供参考。

本指导原则系对医疗器械用重组人源化胶原蛋白原材料的一般要求，适用于人胶原蛋白的所有型别，注册申请人需依据具体医疗器械产品的特性对产品注册申报资料涉及的原材料相关内容进行充实和细化，并依据产品的具体特性确定本指导原则相关内容的适用性。本指导原则不直接涉及重组人源化胶原蛋白原材料制成的医疗器械终产品的安全性或有效性评价，具体产品的评价请参考相应的产品注册审查指导原则。

本指导原则是对注册申请人和技术审评人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料；需在遵循相关法规和强制性标准的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将进行适时的调整。

一、前言

近年来，随着基因重组、蛋白质组学等基础理论、技术手段和临床医疗探索研究的不断发展，重组胶原蛋白日益成为重要的生物材料，为相关医疗器械的研发提供了新的思路与方法。重组人源化胶原蛋白是由DNA重组技术制备的人胶原蛋白特定型别基因编码的全长或部分氨基酸序列片段，或是含人胶原蛋白功能片段的组合。

重组人源化胶原蛋白仅是重组胶原蛋白的一类，材料特性并不能完全决定最终产品的安全性和有效性。本指导原则中的“原材料”是指用于生产制造医疗器械用的重组人源化胶原蛋白材料。除特别说明外，本指导原则中的“材料”等同于“原材料”。

重组人源化胶原蛋白是通过基因工程生产的蛋白，工程细胞构建过程、生产用细胞的质量控制及常规生产过程控制是该原材料生产工艺及风险评价的基础，此方面主要的验证资料，可参考本指导原则的资料性附件作为原材料研究资料的补充，但不作为产品注册申报资料的必要内容。结合重组人源化胶原蛋白的特点，该资料性附件修改引用了国家药监局药审中心《重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制技术评价一般原则》《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则》等生物制品指导原则的相关内容。

二、评价要点

（一） 重组人源化胶原蛋白原材料性能研究

为了确保重组人源化胶原蛋白原材料质量可控，重组人源化胶原蛋白需参考相关行业标准进行必要的鉴别、纯度和杂质等分析，可采用不同的分析方法对原材料的分子量、等电点、氨基酸序列、各种翻译后修饰（如脱酰胺化、氧化、糖谱/糖基化修饰、脯氨酸羟基化等）进行充分鉴定，并进行相应的检测，以确认终产物具有拟宣称的原材料构象、聚集状态、降解状态及胶原蛋白高级结构。

材料理化特性分析需按照医疗器械制备工艺和特点，结合其风险控制要求进行相关研究，建议对如下常规理化项目进行研究，例如氨基酸序列、蛋白空间结构、剂型（如溶液、冻干粉、凝胶、纤维、海绵等）、胶原蛋白型别等特异性性能，同时结合医疗器械特点，完善理化性能指标要求。

需根据不同的预期用途及使用部位、不同生产工艺、预期使用效果和最终医疗器械的状态，选择适用的指标；根据胶原蛋白原材料是否经过交联或化学修饰，宜提供交联剂或修饰剂的残留量、降解性能等的研究，提供相应的研究报告。

性能指标的建立及验证取决于胶原蛋白原材料性质和用途、生产和纯化工艺及生产工艺的经验等多种因素。新的分析技术及对现有技术的改进正在不断进行，适当时需使用这些新的技术。因现有技术原因而产生偏差的需进行合理性解释说明。

1.鉴别

1.1氨基酸序列及覆盖度

首先需明确氨基酸序列的选择依据，如为特定氨基酸序列片段组成的，还需明确片段重复次数及依据。需采用综合的方法测定目标胶原蛋白原材料的氨基酸序列，并与其基因序列对应的理论氨基酸序列进行比较验证。肽段覆盖率的检测结果需为100%覆盖，末端氨基酸序列检测结果需与理论序列完全一致。可按照《重组人源化胶原蛋白》行业标准的要求，直接使用供试品检测，并选择适宜的酶解条件进行水解，酶解后选择不小于5个连续氨基酸的片段为基本的序列单元进行覆盖分析。

如适用，目标胶原蛋白材料的理论氨基酸序列需包括二硫键连接方式。氨基酸序列测定还需考虑可能存在的N端甲硫氨酸（如大肠杆菌来源的胶原蛋白原材料），信号肽或前导序列。

1.1.1氨基酸组成 

使用各种水解法和分析手段测定氨基酸的组成，并与目的蛋白基因序列推导的氨基酸组成或天然异构体比较。如需要时需考虑分子量的大小。多数情况下，氨基酸组成分析对肽段和小蛋白可提供有价值的结构资料，但对大蛋白一般意义较小。在多数情况下，氨基酸定量分析数据可用于确定蛋白含量。

1.1.2氨基酸末端序列 

氨基酸末端分析用于鉴别N-端和C-端氨基酸的性质和同质性。用氨基酸序列分析仪或质谱法测定N端和/或C端氨基酸序列，其结果需符合理论预测。

若发现目的胶原蛋白材料的末端氨基酸发生改变时，需使用适当的分析手段判定变异体的相应变异数量。需将这些氨基酸末端序列与来自目的胶原蛋白基因序列推导的氨基酸末端序列进行比较。

1.2肽图

按照《中华人民共和国药典》 四部 通则 肽图检查法 第一法 胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法进行测定，建立胶原蛋白原材料标准肽图。

推荐利用四极杆飞行时间串联质谱仪（Q-TOF MS）建立标准肽图，作为胶原蛋白材料的指纹图谱，用于材料的批间一致性和稳定性评价，以及材料特异性的鉴别。

需用合适的酶或化学试剂使所选的材料片段产生不连续多肽，应用高效液相色谱法（HPLC）或其他适当的方法分析该多肽片段。尽量应用氨基酸组成分析技术，N-末端测序或质谱法鉴别多肽片段。至少对材料成品放行来说,经验证的肽谱分析经常是确证目的材料结构/鉴别的适当方法。具体分析方法可参考《重组胶原蛋白肽图指纹图谱分析》行业标准。

1.3分子量

对申报医疗器械所用胶原蛋白材料可参照《中华人民共和国药典》高效液相色谱法、“电泳法”的“第五法  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法”、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱方法建立分子量及分布检测方法，也可以运用其他适当技术测定分子量，如分子排阻色谱法等。需通过至少一种合理的、经验证的方法证明其实际分子量与理论预测一致。

高效液相色谱法目标蛋白的出峰保留时间需与参比品一致；高分辨质谱法分子量需与参比品一致；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分子量电泳条带位置需与参比品一致。同时，需就参比品的选择提供合理性依据。

1.4等电点

按照《中华人民共和国药典》 四部通则 电泳法第六法（等电聚焦电泳法）或0542毛细管电泳法进行检测，等电点需在标示范围内，也可以运用其他适当的方法测定。

1.5巯基和二硫键

如果目的胶原蛋白材料的基因序列存在半胱氨酸残基时，需尽可能确定巯基和/或二硫键的数量和位置。使用方法包括肽谱分析（还原和非还原条件下）、质谱测定法或其他适当的方法。

1.6消光系数（或克分子吸光度）

多数情况下，可取目的胶原蛋白材料于UV/可见光波长处测定消光系数（或克分子吸光度）。消光系数的测定为使用UV/可见光或分光光度计检测已知蛋白含量的溶液，蛋白含量应用氨基酸组成分析技术或定氮法等方法测定。

1.7电泳图型

应用PAGE电泳、等电聚焦、SDS－PAGE电泳、免疫印迹、毛细管电泳法或其他适当的方法,获得目的胶原蛋白材料的一致性，同一性和纯度的电泳图谱和数据。

1.8液相色谱图谱

应用分子筛色谱、反相液相色谱、离子交换液相色谱、亲和色谱或其他适当方法，获得目的胶原蛋白材料的一致性、同一性和纯度的色谱图谱和数据。

2.结构表征

2.1脯氨酸羟基化

若在设计时进行脯氨酸羟基化，需按YY/T 1849《重组胶原蛋白》中的要求进行分析，并规定标示值。

2.2高级结构分析

鉴于高级结构与重组人源化胶原蛋白表现出的性能和功能密切相关，若材料拟宣称具有相应的高级结构，采用多种方法对高级结构进行研究分析，包括以下列举的方法及其他结构表征方法，如冷冻电镜、蛋白质晶体结构等方法。

2.2.1三螺旋结构分析

可采用圆二色谱在特定常规试验条件下的检测重组人源化胶原蛋白的CD光谱特征。若采用特定的非常规条件检测，则检测结果仅反映胶原蛋白材料在该条件下可（否）具有形成类似胶原蛋白三螺旋结构的CD光谱特征能力；此时需分析并阐述所检测样品是否代表“原材料样品”，还是“原材料样品”的特定处理（后续加工）样品。同时建议进行最低检出限分析，其结果需与生理性胶原蛋白相近（相差不超过一个数量级）。可采用X射线晶体学技术或冷冻电镜技术在原子结构水平考证胶原蛋白材料或其包含的特定氨基酸序列的三螺旋结构特性，计算有结构信息的序列占整个蛋白序列的百分比；可采用差示扫描量热法检测胶原蛋白材料结构变化的热效应辅助说明胶原蛋白的高级结构特征；可采用红外光谱进行结构分析，其非特征区（如：酰胺a、b）和特征区（如：酰胺I、酰胺II、酰胺III）的特征峰位置需与参比品一致；可采用拉曼光谱，其拉曼光谱图需与参比品一致；也可应用其它紫外或可见光吸收光谱法、核磁共振（NMR）等适当的方法检测。

2.2.2纤维质量/多孔网状结构表征

若材料预期形成纤维/网状结构时，宜使用扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）或原子力显微镜（AFM）等方法观察胶原蛋白材料形成胶原纤维束/多孔网状结构等，需明确两种方法具体的制样和观察测定过程。与此相关的胶原分子自组装和聚合能力分析，可参考相关国内外相关标准进行研究。

3.纯度

关于纯度的要求可根据医疗器械终产品的用途和用法而确定。存在二硫键时重组人源化胶原蛋白可能会形成寡聚体，且其电泳分子量大小需成倍增加，寡聚体需视为重组人源化胶原蛋白而非杂质。

4.含量

需建立重组人源化胶原蛋白含量检测方法，含量以质量/重量或质量/体积表示。含量检测可通过液相色谱法（HPLC）、凯氏定氮法、特征多肽法等。

5.杂质、污染物和添加剂

对胶原蛋白材料工艺相关杂质以及外源污染物等进行研究，如：细胞基质来源、细胞培养来源和下游工艺。需对潜在的工艺相关杂质（如宿主细胞蛋白质、宿主细胞DNA、细胞培养残留物、下游工艺的残留物等）进行鉴别、评估，并进行定性和/或定量分析，并采用适宜的方法评价其对生物学功能的影响。工艺相关杂质来源于生产工艺，可分三大类：来源于细胞基质、培养基和下游工艺。细菌内毒素、微生物限度和无菌性，是常规的污染物控制要求。

5.1源于细胞基质的杂质 

来源于细胞基质的杂质包括源于宿主生物体的蛋白/多肽；核酸（宿主细胞/载体/总DNA）；多糖及病毒。对于宿主细胞蛋白，一般需用能检测出较宽范围蛋白杂质的灵敏的免疫检测方法。需用不含目的基因的生物体粗提物，即不含胶原蛋白编码基因的生产用细胞，制备上述试验使用的多克隆抗体。可通过对胶原蛋白材料的直接分析方法（如杂交技术法）检测宿主细胞的DNA水平，和/或通过标记试验（实验室规模）检测证实通过纯化工艺能去除核酸。对于有意导入的病毒，需验证生产工艺中去除/灭活病毒的能力。

5.1.1外源性DNA残留量

按照《中华人民共和国药典》“外源性DNA残留量测定法”的“荧光染色法”或“定量PCR法”进行测定，“荧光染色法”的样品加标回收率需满足70%～130%；“定量PCR法”的样品加标回收率需满足50%～150%，需规定残留限量。如果样品中外源性DNA残留量低于“荧光染色法”的检测限，则需采用“定量PCR法”进行测定。

需根据医疗器械产品的预期临床用途、使用量等，确定含重组人源化胶原蛋白的材料临床最大使用量的外源性DNA残留量限值。推荐参考生物制品外源性DNA残留限量要求，结合残留DNA宿主类型及其风险程度设定每人每次最大使用量限值。

建议参考生物制品中大肠杆菌或酵母菌表达的基因工程重组生物制品的外源性DNA残留量限度。

5.1.2宿主细胞蛋白质残留量

5.1.2.1大肠杆菌蛋白质残留量

按照《中华人民共和国药典》“大肠埃希菌菌体蛋白质残留量测定法”或采用经验证的酶联免疫试剂盒进行测定。

5.1.2.2酵母蛋白质残留量

按照《中华人民共和国药典》“酵母工程菌菌体蛋白质残留量测定法”或采用经验证的酶联免疫试剂盒进行测定。

5.1.2.3CHO细胞蛋白质残留量

采用经验证的酶联免疫试剂盒进行测定。

5.1.3促炎性污染物（肽聚糖）

采用经验证的方法或经验证的市售细菌肽聚糖检测试剂盒（ELISA）检测残留肽聚糖，需根据其致热反应风险规定可接受的限量要求。

5.1.4碳水化合物结构

根据细胞基质等因素，必要时需考虑测定糖蛋白中碳水化合物的含量（中性糖、氨基糖、唾液酸）。此外，尽可能分析碳水化合物的结构、寡糖形态（长链状）和多肽的糖基化位点。

5.2源于培养基的杂质

来源于培养基的杂质包括诱导剂（多核苷酸，病毒）、抗生素、血清及其他培养基组分。需根据工艺中采用的表达体系和使用的抗生素类型，采用经验证的方法测定残余抗生素含量/活性，残余抗生素含量需符合《重组人源化胶原蛋白》行业标准等相关标准，不应有残余抗生素活性。

残余抗生素含量的测定按照YY/T 1849《重组胶原蛋白》中描述的方法或其他经验证的方法进行检测，残余抗生素活性按照《中华人民共和国药典》 四部通则 生物活性测定法中抗生素微生物检定法或《中华人民共和国药典》 四部通则 抗生素残留量检查法进行检测。

5.3源于下游工艺产生的杂质

来源于下游工艺产生的杂质一般包括酶、化学/生化处理试剂（如溴化氰、胍、氧化剂和还原剂）、无机盐（如重金属、砷、非有色金属离子）、溶剂、载体/配体（如单克隆抗体），及其他可滤过的物质。需结合实际情况制定相关理化指标。

5.3.1添加剂

如果使用了防腐剂、冻干保护剂等添加剂，需给出其限量要求和检测方法。

5.3.2重金属及微量元素含量需符合以下规定。

5.3.2.1重金属元素

对工艺中添加的重金属元素，需符合规定限值。

5.3.2.2重金属含量

重金属总量（以Pb计）需符合YY/T 1888《重组人源化胶原蛋白》行业标准等相关标准中的限值。

5.3.2.3微量元素含量

微量元素含量：砷（As）、汞（Hg）、铅（Pb）、铬（Cr）、镉（Cd）、铜（Cu）、钼（Mo）、铁（Fe）、镍（Ni）需符合YY/T 1888《重组人源化胶原蛋白》等相关标准中的要求。

5.4细菌内毒素

细菌内毒素相关限量要求需考虑医疗器械终产品与人体的接触方式。

5.5微生物限度

若重组人源化胶原蛋白材料以微生物限度控制状态提供，按照《中华人民共和国药典》 四部通则 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法和非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法进行检测，结果需符合相关要求。

5.6无菌

若重组人源化胶原蛋白材料以无菌状态提供，按照《中华人民共和国药典》 四部通则 无菌检查法进行检测，结果需无菌。

5.7分子变异体

需对重组人源化胶原蛋白材料的各种分子变异体进行分离、鉴别和分析。如变异体的功能与目标产物一致时可不做杂质考虑。需考虑在生产和/或贮存期间胶原蛋白材料降解产物是否显著增加及其与免疫原性的相关性。以下为最常见的目的胶原蛋白材料的分子变异体，并列出了相应的检测方法。

5.7.1化学修饰类型

各种非预期的翻译后修饰是导致重组蛋白异质性的重要质量问题，如：脱酰胺化、氧化、糖谱/糖基化修饰等和其他可能的N端、C端修饰（如乙酰化、酰胺化或者由于外肽酶导致的部分降解以及C端加工、N端焦谷氨酸等），以及各种其他异质性（如异构化、碎片化、二硫键错配、N-连接和O-连接的寡糖、聚集等）。适用时，需按YY/T 1849《重组胶原蛋白》中的要求，参照《重组胶原蛋白肽图指纹图谱分析》行业标准等相关标准进行分析。需考虑脱酰胺、异构化、错配二硫键连接和氧化形式的分离和鉴别。对这些变异体的分离和鉴别，可采用层析法、电泳法（如毛细管电泳）、质谱法和/或光谱法（如圆二色谱）。需注意在修饰不会引起或只引起较小的分子量变化及结构变化的情况下，这些方法可能无法鉴别。此时，需要结合功能性试验，评价所发生的修饰是否影响预期的功能和使用。

5.7.2降解物和聚合体

降解物和聚合体：聚合体包括二聚体和多聚体，可用分子筛层析法（如SE-HPLC）进行定量；需建立成品中非预期降解物的判定标准，并对稳定性试验产生的降解产物进行监测。

6.热稳定性

如果重组人源化胶原蛋白是多聚体，可采用差示扫描量热分析（DSC）进行解聚温度分析。可参考《中华人民共和国药典》 四部。

如果是单链的蛋白肽，可参考《中华人民共和国药典》 四部，人免疫球蛋白3.3.2.4热稳定性试验，将供试品置（57±0.5）℃水浴中保温4h后，用可见异物检查装置，肉眼观察需无凝胶化或絮状物。

7.其它理化指标

胶原蛋白材料其它性能指标宜根据医疗器械终产品特性及相关通用要求制定，在适用时，需对相关性能指标检测方法使用的参比品进行性能研究，对照品技术参数需明确且性能稳定。用于理化测定等方面的参比品，需进行必要的分析鉴定，包括但不限于：

7.1外观（如性状、颜色）

用肉眼直接观测，需为白色/淡黄色/无色透明液体或凝胶，或白色/类白色冻干粉或海绵状固体。

注：随着行业发展，可能存在其他外观要求，需根据原材料具体形态规定外观要求。

7.2可见异物

按照《中华人民共和国药典》 四部通则 可见异物检查法第一法（灯检法）进行检测，需无明显异物。

7.3溶解性

需根据供试品的溶解特性，对供试品在水、稀酸或中性盐溶液中的溶解程度进行表征和阐述。

7.4水分

适用时（如冻干样品），需明确水分含量。除另有规定外，取供试品约1g～2g，按照《中华人民共和国药典》“水分测定法”第二法（烘干法）测定，或取供试品约10mg按照《中华人民共和国药典》“热分析法”热重法（TG）测定，升温程序：从室温以10℃/min速率升温至105℃，保持60min。减失重量需符合所标示范围。规定仲裁方法为水分测定法。

7.5炽灼残渣

除另有规定外，取1.0-2.0g，按照《中华人民共和国药典》 四部通则 炽灼残渣检查法进行检测。

7.6酸碱度

液体和凝胶样品直接取样，固体样品用生理盐水稀释为1mg/mL，按照《中华人民共和国药典》 四部通则“pH值测定法”进行检测，需符合所标示值的±1.0。

7.7渗透压摩尔浓度

适用时，液体和凝胶样品直接取样，固体样品用生理盐水稀释为1mg/mL按照《中华人民共和国药典》 四部通则 渗透压摩尔浓度测定法进行检测，渗透压摩尔浓度范围需符合相关标准要求。

7.8动力黏度（凝胶）

取供试品按照《中华人民共和国药典》“黏度测定法”的“旋转黏度计测定法”测定，需要详细描述试验条件，动力黏度值需符合所标示范围。

7.9装量及差异

根据供试品性状（溶液、凝胶、冻干海绵或冻干粉末等）和装量的不同确定装量的允差要求。例如：20g（mL）以下，单个装量不低于标示装量的93%；20g（mL）至50g（mL），单个装量不低于标示装量的95%；50g（mL）以上，单个装量不低于标示装量的97%；平均装量不低于标示装量。

8.降解特性及产物

需对胶原蛋白材料降解特性进行研究，可采用凝胶渗透色谱（GPC）测定降解产物的分子量分布及分子量，水解/酶解产物可使用氨基酸分析仪、高效液相色谱或其他适宜的方法测定。

9.生物学功能评价

重组胶原蛋白的生物学功能是指以重组胶原蛋白生物学特性相关属性为基础的生物学作用，对声称的生物学功能宜进行定性定量分析。胶原是细胞外基质的主要成分，重组人源化胶原蛋白作为重组胶原蛋白的一种，其主要生物学功能也同样是为细胞提供支架和良好的微环境，如促进细胞黏附、增殖、生长、分化等。因此，可通过评价细胞-胶原蛋白相互作用来评价重组人源化胶原蛋白的生物学功能。细胞增殖、分化、黏附性、迁移或移行评价方法可参考YY/T 1849《重组胶原蛋白》。

由于胶原类材料在分子组成、微结构、物理性能方面可能差异显著，需检测材料与细胞之间相互作用及其引导细胞基础响应的性能。细胞响应的参数包括细胞形态、面积和体积，均可通过二维（2D）或三维（3D）图像技术可视化评价，还包括存活率、增殖率、程序化凋亡以及迁移。

鼓励对重组人源化胶原蛋白对细胞的作用机理进行研究。例如，抗体阻断试验可用来确定细胞表面的何种受体参与了与胶原的作用，如整合素或盘状结构域受体（DDRs）。此外，细胞骨架成分（如肌动蛋白）的协同作用也可用来评价细胞与基质间的粘附与收缩解离。有多种在单细胞或多细胞水平上评价细胞引导的收缩解离的方法，包括自由漂浮组织构建物的尺寸随时间的变化、施加在培养-力学监测系统上力的大小，以及单个细胞在胶原网络的应力和形变等。

其它适用于干细胞和祖细胞类型的细胞-胶原相互作用的功能性检测包括细胞株的定向分化，特定干细胞或祖细胞的增殖，或组织形态发生（始于内皮祖细胞的血管形成）。按照《中华人民共和国药典》 四部 进行成纤维细胞生长因子生物学活性测定，对胶原蛋白肽-细胞相互作用评价，反映胶原蛋白肽与成纤维细胞增殖的构效关系。

按照《中华人民共和国药典》 四部 生物活性测定法对试验结果进行统计学分析，包括对验证指标结果的绘图和统计学分析，以及判断其是否符合可接受标准等。常规的统计学方法一般要求数据之间相互独立，并呈近似正态分布和方差齐性，通常采用相对效价的对数转换值进行数据分析。当无法满足上述统计学要求时，也可考虑采用其他适宜的替代方法进行数据分析。

上述关于胶原—细胞相互作用的功能性测定也可作为医疗器械产品标准化和质量控制的方法。三维支架材料中细胞活性评价方法可参考YY/T 1562《组织工程医疗器械产品 生物材料支架 细胞活性试验指南》。

（二） 材料免疫学安全性研究

临床前安全性评价包括临床前安全性试验，其目的主要是确定新胶原蛋白材料是否会在人体引起未能预料的不良反应，免疫学安全性研究是重组人源化胶原蛋白材料生物安全性研究资料的主体。但是，用传统生物试验方法来评价重组人源化胶原蛋白往往有困难，并受多种因素的影响。例如高度的种属特异性，人的蛋白质对人的生物学活性远高于对动物的活性，而且人的蛋白质氨基酸序列，常常与来自其它种系的蛋白质不同，例如糖基。因而由基因工程技术所制备的蛋白质或肽类往往会在人体以外的其它宿主中产生免疫应答，其生物学效应有所改变，并可能因形成免疫复合物而导致有毒性反应，而这样产生的毒性反应与人体安全性显然无关。

另外，由于重组人源化胶原蛋白功能、生产工艺或者胶原蛋白材料稳定性等要求，对胶原蛋白材料进行修饰或者改构，需提供与未修饰或者改构材料比较的研究资料。以简化生产工艺为目的而引入的额外多肽片段如His-tag，在最终的材料成品中需符合相关行业标准的要求。

1.免疫原及免疫化学检验

基于部分人胶原蛋白核酸序列进行编辑组合而重组的蛋白质产物，特别是长期反复使用时，可能引起人体预测不到的免疫原性。因此，不能完全排除其免疫原性风险，宜增加免疫学研究。重组人源化胶原蛋白作为医疗器械用原材料，可采用适宜方法进行免疫学评价。若用动物进行免疫学试验，可能因为动物模型与临床应用之间存在种属差异，带来对评价试验结果或评价试验数据使用上的局限，需要根据临床评价获得的免疫学评价数据及动物模型获得的免疫评价数据进行综合评价分析。

患者对蛋白质类材料产生免疫应答的风险将随医疗器械产品变化而变化。建议采用基于风险的方法来评价和减轻与影响人源化胶原蛋白安全性和有效性相关的免疫应答。人源化胶原免疫原主要源自生产过程中残留的可致免疫原性的各种因子，包括残留的各种杂蛋白（包括DNA转录过程中可能产生的异种蛋白）、残留的大肠杆菌及酵母菌外源性DNA、材料致热原、生产过程中菌体产生的细菌内毒素、DAMPs以及人源胶原特异性免疫等等。

为降低人源化胶原蛋白材料的免疫原性风险，一般需在材料设计及生产工艺中采取相应处理措施以降低其免疫原性，如宿主细胞选择，蛋白提取、蛋白纯化。注册申请人需对其降低材料免疫原性的有效性进行验证，并提供验证试验性数据或相关研究资料。注册申请人需提供免疫原性检测范例的理论依据，需使用经完全验证的检测法对来自关键性研究的样品进行检测，并提供支持该检测法的全面验证的数据。

杂蛋白的检测可参考YY/T 1453《组织工程医疗器械产品 I型胶原蛋白表征方法》，外源性DNA检测可参考YY/T 0606.25《组织工程医疗产品 第25部分 动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法》。胶原蛋白材料的免疫原检验可通过流式细胞术（FCM）或酶联免疫吸附法（ELISA）测定，检测试验宜考虑，但不限于淋巴细胞增殖试验（YY/T 0606.15《组织工程医疗产品 第15部分 评价基质及支架免疫反应的试验方法：淋巴细胞增殖试验》）、细胞迁移试验（YY/T 0606.20《组织工程医疗产品 第20部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：细胞迁移试验》），采用非标方法时需进行方法学验证。

免疫原性检测可设计为检测不期望的生物或生理结果的抗体，重组人源化胶原蛋白抗体可能降低效果或者引起过敏等反应。抗体检测的免疫原试验可参考《中华人民共和国药典》，选择适宜的方法进行，包括桥联或均相酶免疫法、放射免疫沉淀试验等，并进行相关的方法开发和试验验证。试验过程中，可根据滴度试验和中和活性试验进一步对ADA进行分析，还可进行额外的抗体特征分析，包括抗体分型、抗原表位鉴定及交叉反应评价。

筛选检测法（也称为结合抗体（BAb）检测法）用于检测与材料结合的所有抗体。使用确证性检测法建立BAb对材料的特异性，使用滴定和中和检测法进一步表征重组人源化胶原蛋白抗体。使用滴定检测法表征抗体应答的量级，抗体对安全性和有效性的影响可能与其滴度和持续性而不是发生率相关。中和检测法评估抗体干扰材料-靶标相互作用的能力。中和抗体（NAb）是BAb的亚类，ADA对安全性和有效性的影响可能与NAb活性而不是抗体发生率相关。类似地，在一些情况下可能重要的是确定NAb滴度。用于检测抗体的首选检测法应当是检测低亲和力和高亲和力抗体的高灵敏度筛选检测法。注册申请人在开发检测方法以确认重组人源化胶原蛋白特异性抗体结合时，需选择合适的确证性检测法以防止抗体假阳性数据，这些假阳性数据会混淆抗体对安全性和有效性影响的分析。

注册申请人需提供支持该检测法的全面验证的数据。验证包括证明用于给定样品中抗体的定量测量的特定检测法对于预期用途是可靠和可重现的。抗体检测法有助于评价材料的免疫原性，然而抗体的检测依赖于检测法的关键操作参数（如灵敏度、专属性），一般来说，建议注册申请人开发针对灵敏度、专属性、选择性、精确度、重复性和稳定性进行优化后的检测法。

其他的免疫原评价及生物学性能及生物相容性评价等建议做医疗器械终产品的检测，因为加工工艺不同最终产品性能不同，例如有些交联工艺可能会封闭某些免疫原反应簇等等。

2.免疫毒理学评价

当拟生产医疗器械免疫原性风险与已上市产品无可比性，且无充分的文献数据评价其免疫原性，需进行免疫毒理学试验研究。通过免疫毒理学试验，对炎症反应、免疫抑制、免疫刺激、超敏反应以及自身免疫进行确证评价，评估免疫系统改变导致的潜在人体不良健康作用。

免疫毒理学可通过流式细胞术（FCM）、酶联免疫吸附法（ELISA）、组织病理切片等方法测定，试验方法可考虑结合生物学试验、体外T淋巴细胞转化试验（YY/T 1465.1《医疗器械免疫原性评价方法 第1部分 体外T淋巴细胞转化试验》）等，注册申请人需对选用检测方法的适用性进行评价，采用非标方法时需进行方法学验证。

可参考GB/T 16886.20《医疗器械免疫毒理学试验原则和方法》选择性进行功能性或非功能性免疫毒理学试验，通过啮齿动物试验方式检测和评价物质的不良作用。目前主要研究方法是将医疗器械/材料植入小鼠/模式小鼠，然后研究器械/材料整个降解周期内机体的体液和细胞的免疫应答，以及局部组织的免疫反应。功能性检测测定细胞和/或器官活性，例如淋巴细胞对有丝分裂原或特异性抗原的增殖反应、细胞毒性和特异性抗体的形成；非功能性检测涵盖形态学方面和/或定量的术语、淋巴组织变化程度、淋巴细胞数目和免疫球蛋白水平或其他免疫功能标志物。

（三） 材料生物学风险评价

作为制备医疗器械产品的原材料，需参照GB/T 16886.1的要求对重组人源化胶原蛋白原材料进行必要的生物学评价，尤其通过胶原蛋白材料到医疗器械终产品的加工工艺分析发现，两者之间的生物学风险相近时。如预期用于植入产品的原材料，还需评估样品是否为内源性凝血系统激活物。若医疗器械终产品与胶原蛋白材料的使用方法不一致，需考虑生物学补充研究。

根据GB/T 42062《医疗器械 风险管理对医疗器械的应用》描述的风险管理过程进行生物学风险评定，识别材料、添加剂、加工助剂和其他潜在可沥滤物中的危害，接触剂量等因素，绘制基于风险管理的生物学评价流程图。

如果医疗器械产品以非灭菌的方式提供，可将样品灭菌后用于生物学评价试验，需考虑灭菌方式及灭菌对重组人源化胶原蛋白的影响。

可能需要评价的生物学风险评定终点包括但不限于：

1.细胞毒性

2.致敏性

注射胶原、胶原止血剂等具有潜在生物可降解性材料，或体内植入材料以及材料制备过程中新增了化学成分和制造加工助剂、装配粘合剂/溶剂残留物，以及成品中可能存在灭菌残留物或灭菌过程所致的反应性产物时，需进行迟发型超敏反应试验。

3.皮肤刺激性

4.皮内反应

注射胶原、胶原止血剂等具有潜在生物可降解性材料或体内植入材料以及材料制备过程中新增化学成分和制造加工助剂、装配粘合剂/溶剂残留物以及灭菌残留物或灭菌过程所致的反应性产物可能存在于成品时需进行皮内刺激试验。

5.材料介导的致热性

6.全身毒性

7.溶血性

血管修复材料、创伤和烧伤修复材料、胶原止血剂、心脏瓣膜等与循环血液接触的外部接入材料和大部分植入材料以及全部植入血管系统材料需进行溶血试验。

8.植入反应

皮下植入（胶原支架、血管修复材料、创伤和烧伤修复材料、胶原止血剂等可降解/可吸收材料或需植入生物材料等需进行皮下组织植入试验进行评价）；肌肉植入；骨植入。

9.遗传毒性。

（四） 稳定性研究与直接接触性容器/材料研究

1.稳定性研究

重组人源化胶原蛋白生产过程中间体如涉及到贮存，则需开展相应的稳定性研究。采用拟贮存阶段样品的代表性批次开展研究，一般包括贮存、运输（如适用）和使用稳定性研究等。研究开展前，需统筹制定稳定性研究方案，关注各稳定性研究所用样品、直接接触性容器/材料、检测时间点、检测条件和分析检项等。

研究中需对能够反映质量变化的敏感特征进行研究，如含量、完整性、纯度、微生物安全性和生物学特性等。需依据相应的医疗器械产品的贮存运输条件开展研究，涵盖设定的各项条件，如温度、光照、反复冻融（冷冻贮存时）、振摇等方面。根据实际使用情况，开展使用中的稳定性研究，例如复溶或解冻、与复溶稀释剂的相容性研究等。研究中需采用与实际使用相同材质的直接接触性容器/材料。

2.直接接触性容器/材料研究

如涉及贮存，需对直接接触的包装容器开展相应的包材相容性研究。根据相容性研究结果，结合稳定性研究，选择合理的包装容器。

另外，对制备工艺中与样品接触的容器和一次性使用材料（如贮存袋、过滤膜、层析介质、管路等），需开展风险评估和/或相应的相容性研究。

三、参考文献

[1]中华人民共和国国务院.医疗器械监督管理条例:中华人民共和国国务院令第739号[Z].

[2]国家市场监督管理总局.医疗器械注册与备案管理办法:国家市场监督管理总局令第47号[Z].

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典:三部[M].北京:中国医药科技出版社,2020.

[4]YY/T 0954,无源外科植入物 I型胶原蛋白植入剂[S].

[5]YY/T 1453,组织工程医疗器械产品 I型胶原蛋白表征方法[S].

[6]YY/T 0606.25,组织工程医疗产品 第25部分 动物源性生物材料DNA残留量测定法:荧光染色法[S].

[7]YY/T 1849,重组胶原蛋白[S].

[8]YY/T 1888,重组人源化胶原蛋白[S].

[9]YY/T1562,组织工程医疗器械产品生物材料支架 细胞活性试验指南[S].

[10]GB/T 16886.1,医疗器械生物学评价 第1部分：风险管理过程中的评价与试验[S].

[11]国家药品监督管理局药品审评中心.治疗用生物制品非临床安全性技术审评一般原则:2007年[Z].

[12]国家药品监督管理局药品审评中心.人用重组DNA制品质量控制技术指导原则:2003年[Z].

[13]国家药品监督管理局药品审评中心.特异性人免疫球蛋白药学研究与评价技术指导原则:国家药监局药审中心通告2022年第27号[Z].

[14]国家药品监督管理局药品审评中心.重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制技术评价一般原则:2007年[Z].

[15]国家药品监督管理局药品审评中心.体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则:国家药监局药审中心通告2022年第29号[Z].

[16]国家药品监督管理局.重组胶原蛋白生物材料命名指导原则:国家药监局通告2021年第21号[Z].

[17]U.S. Food and Drug Administration. Guidance for Industry: For the Submission of Chemistry, Manufacturing, and Controls Information for a Therapeutic Recombinant DNA-Derived Product or a Monoclonal Antibody product for in vivo use [EB]. 1996-08.

[18]U.S. Food and Drug Administration. Guidance for Industry: Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products —Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection [EB]. 2019-01.

[19]European Medicines Agency. Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology-derived proteins as active substance: non-clinical and clinical issues [EB]. 2014-12-18.

[20]MEYER M. Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties[J]. Biomedical engineering online, 2019, 18(1): 24-24.

[21]Rezvani Ghomi E, Nourbakhsh N, Akbari Kenari M, et al. Collagen‐based biomaterials for biomedical applications[J]. Journal of biomedical materials research. Part B, Applied biomaterials, 2021, 109(12): 1986-1999.

[22]Gentile, Ferreira, A. M, et al. Collagen for bone tissue regeneration[J]. Acta Biomater, 2012 Sep, 8(9):3191-3200.

[23]Schor SL. Cell proliferation and migration on collagen substrata in vitro[J]. J Cell Sci, 1980 Feb, 41:159-175.

[24]Somaiah C, Kumar A, Mawrie D, et al. Collagen Promotes Higher Adhesion, Survival and Proliferation of Mesenchymal Stem Cells[J]. PLoS One, 2015 Dec 14, 10(12): e0145068.

[25]Luparello C, Sirchia R. Type V collagen regulates the expression of apoptotic and stress response genes by breast cancer cells[J]. J Cell Physiol, 2005 Feb, 202(2): 411-421.

[26]Urlaub, G., Kas, E., Carothers, A. M., et al. Deletion of the diploid dihydrofolate-reductase locus from cultured mammalian-cells[J]. Cell, 1983, 33: 405-412.

[27]Cregg J. M., Vedvick T. S., Raschke W. C.. Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris[J]. Biotechnology, 1993 Aug, 11(8): 905-910.

[28]Jeong, H., Barbe, V., Lee, C. H., et al. Genome Sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3) [J]. Journal of Molecular Biology, 2009, 394(4): 644–652.

[29]Gussow D., Clackson T. Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain-reaction[J]. Nucleic Acids Research, 1989, 17: 4000.

[30]Kubista M, Andrade JM, Bengtsson M, et al. The real-time polymerase chain reaction[J]. Molecular aspects of medicine, 2006, 27: 95-125.

[31]Cereghino, J. L., Cregg, J. M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J]. Fems Microbiology Reviews, 2000, 24: 45-66.

[32]Cereghino, G. P. L., Cereghino, J. L., Ilgen, C., et al. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13: 329-332.

[33]Hollenberg, C. P., Gellissen, G. Production of recombinant proteins by methylotrophic yeasts[J]. Current Opinion in Biotechnology, 1997, 8: 554-560.

[34]Barker, J. Material change[J]. Nature, 1988, 333: 310.

Gräslund Susanne, Nordlund Pär, Weigelt Johan, et al. Protein production and purification [J]. Nature Methods, 2008, 5(2): 135-146.

附件：重组人源化胶原蛋白原材料制造过程控制